Voou pela primeira vez no dia 21 de Dezembro de 1988. A aeronave estava em uma demonstração estática no Show Aéreo de Paris, em 1989, e voou durante os dias liberados ao público no Show Aéreo Internacional de Farnborough, em 1990. Duas aeronaves foram encomendadas, que atualmente são operadas pela Antonov Airlines, matriculadas UR-82060 e UR-82070. Estes são disponíveis comercialmente para carregar cargas excessivamente pesadas e grandes, para até 250.000 kg internamente, ou ainda 200.000 kg na área superior à fuselagem. A carga na parte superior da fuselagem pode ter até 70m de comprimento.
O segundo Antonov An-225 foi construído parcialmente durante o final da década dos anos 80 para o uso do Programa Espacial Soviético. O desenho do segundo An-225 incluía uma porta de carga traseira e uma cauda redesenhada com um único estabilizador vertical, desta forma, sendo mais efetivo para o transporte cargueiro. Após o colapso da União Soviética em 1990 e o cancelamento do Programa Espacial do Buran, este Antonov An-225 foi armazenado em 1994. Os seis motores Ivchenko-Progress foram removidos de uso nos Antonov An-124. O primeiro Antonov An-225 foi mais tarde re-motorizado e colocado em serviço.
No ano de 2000, se tornou aparente a necessidade de um Antonov An-225 adicional, e foi decidido em Setembro de 2006, completar a construção do segundo Antonov An-225. Esta segunda aeronave tinha encomenda prevista por volta de 2008, mas foi adiada.
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